那么它具体怎么培养呢？

一、IPSC培养之实验前准备

   试剂：预热的无滋养层培养基（如mTeSR™ Plus， E8）、基质胶包被的培养板、解离试剂（如 Gentle Cell Dissociation Reagent， 不含酶）、PBS、ROCK抑制剂（Y-27632）。

   设备：37°C， 5% CO?培养箱，倒置显微镜，超净工作台。

二、IPSC培养之基质胶包被培养板

   用预冷的PBS或无血清DMEM按说明书比例稀释基质胶。

   迅速将稀释液加入培养板中（6孔板约1 mL/孔），室温静置至少1小时或4℃过夜。

   使用前吸弃包被液，无需晾干，直接接种细胞。

三、IPSC培养之日常观察与换液

   每日观察：在显微镜下观察细胞状态。健康的iPSC克隆应边界清晰、细胞核大、核质比高、克隆内细胞排列紧密。边缘出现扁平、拉长或透明的细胞是分化的征兆。

   换液：每天换液一次。轻柔吸弃旧培养基，沿孔壁缓慢加入预温的新鲜培养基，避免吹打克隆。

四、IPSC培养之传代（关键步骤）

iPSC通常每4-7天传代一次，当克隆大到开始互相接触时进行。

   方案A：酶解法（EDTA或Accutase）：

    1.  吸弃培养基，用PBS轻柔清洗一次。

    2.  加入适量含0.5 mM EDTA的PBS或Accutase，37℃孵育3-5分钟。

    3.  在显微镜下观察，当克隆边缘开始卷起、细胞间隙变大时，迅速吸弃解离液。

    4.  加入含10 μM ROCK抑制剂的完全培养基，用1mL移液器轻柔吹打成小团块（约几十到几百个细胞一团）。切忌吹成单细胞！

    5.  离心，重悬，按适当比例（通常1:6至1:20）接种到新包被的板上。

   方案B：手动挑克隆法：

       用于去除分化部分、单克隆筛选或处理珍贵细胞系。

       在显微镜下用拉细的巴斯德管或专用挑针，物理刮取未分化的克隆区域，转移至新孔。

   关键点：传代后24小时内，在培养基中加入ROCK抑制剂，可显著提高克隆形成率和存活率。

五、IPSC培养之冻存与复苏

   冻存：使用适合无血清培养的专用冻存液（如CryoStor® CS10），或含10% DMSO + 30%血清替代物 + 60%基础培养基的自配冻存液。以小团块形式冻存。

   复苏：

    1.  快速解冻细胞。

    2.  用含大量ROCK抑制剂的培养基重悬并接种。

    3.  24小时后全量换液为正常培养基。

六、 常见问题与对策

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