离心柱法主要是利用离心柱中的硅胶基质吸附RNA，再通过洗涤去除杂质从而得到RNA的一种常用方法。相较于Trizol法，离心柱法因操作简便、耗时短、纯度高等优点而得到广泛应用，但也因其吸附柱规格的限制在大批量操作时具有一定的局限性，此外，针对特殊的样本，其提取的效果也大不如Trizol法好。那么你知道柱式法RNA提取的实验流程和注意事项是什么吗？让我们一起来看看吧！
 

　　一、主要的试剂、仪器与耗材
 

　　RNA提取试剂盒、氯仿、无水乙醇、RNase free Water、低温冷冻离心机、匀浆器或组织研磨器、微量移液器、通风橱、计时器、1.5ml EP管、2ml EP管等。
 

　　二、 提取步骤
 

　　1.样品处理：
 

　　· 细胞：贴壁细胞每106细胞加入1ml裂解液，吹打混匀。
 

　　· 悬浮细胞：植物、动物、酵母每10^6细胞加入1ml裂解液。
 

　　· 细菌细胞每107细胞加入1ml裂解液混匀。
 

　　· 组织：新鲜或-70℃冻存100mg组织加1ml裂解液，匀浆处理。
 

　　2.室温放置5min，使核酸蛋白复合物分离；
 

　　3.向匀浆样品中加入0.2ml的氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15s，室温放置3-5min；
 

　　4.2-8℃，12000rpm离心10min。RNA主要存在于上层水相中把水相转移至新的EP管中(注：不可吸到沉淀)；
 

　　5.吸附柱前处理：在吸附柱中加入500ul洗柱液，室温放置2min，2-8℃，12000rpm离心2min，弃废液(小Tips：此步可以在第四步离心还剩2min左右的时候进行，这样第四步离心结束就可以直接进行洗柱，而不需要再等时间)；
 

　　6.在收集的上清中加入200ul无水乙醇混匀，加入吸附柱中静置2min，2-8℃，12000rpm离心2min，弃废液；
 

　　7.向吸附柱中加入600ul漂洗液(注：新买的试剂盒中漂洗液还需要加入一定量的无水乙醇，此步一定要确认漂洗液是否加入无水乙醇)，2-8℃，12000rpm离心2min，弃废液；
 

　　8.向吸附柱中加入600ul漂洗液，2-8℃，12000rpm离心2min，弃废液(注：漂洗液在7-8步共加了两次哦)；
 

　　9.12000rpm离心2min，弃掉收集管，将吸附柱置于室温数分钟(10-15min)以去除残留的漂洗液(注：最好在通风橱进行，以免RNA酶对RNA的降解；通风橱在使用前也可先紫外30min)；
 

　　10.将吸附柱放入新管中，向膜中央滴加50-100ul RNase free ddH2O(通常取中间值)，室温放置5min，12000rpm室温离心2min即可得到RNA溶液(注：所有步骤中仅最后一步离心是在室温，其余均在2-8℃，因此，前几步离心拿出样品后一定要及时关上离心机盖子，以免升温，而在第9步离心结束后就可以打开离心机盖子使其快速升至室温)。
 

　　三、 注意事项
 

　　1.佩戴手套、口罩，消毒操作台，杜绝外源酶的污染；
 

　　2.所用试剂耗材必须无酶化，有条件者可以直接购买，否则就要做好高压灭菌的工作；
 

　　3.得到RNA溶液后可保存于-80℃，避免反复冻融，放置时间不可过长；4.对于组织RNA的提取，一定要充分匀浆处理以使RNA充分释放出来。
 

　　更多有关柱式法RNA提取的实验流程和注意事项，请联系天津益元利康生物科技有限公司。